基于网络药理学的南、北五味子治疗阿尔茨海默病作用机制比较研究

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，以记忆减退、认知障碍、行为损害、日常生活功能丧失为主要特征［1］。目前AD的治疗研究多与典型组织病理学、皮质淀粉样蛋白斑块、神经纤维缠结和家族性AD相关的突变有关［2］，同时，AD患者可能出现星形胶质细胞增生、炎症反应、神经元营养不良等病理特征［3］。随着人类寿命延长和人口老龄化，全球AD的发病率预计持续增长。调查表明［4］，在2050年全球AD的发病人数将超过1亿人次，且AD的发病率在65岁以上的老年人中急剧增加。AD对患者生存质量产生影响的同时也加剧家庭和社会负担。因此，对AD的防治策略亟待进一步研究。

五味子最早记载于《神农本草经》中，列为上品［5］。《中国药典》2020年版［6］中，将南、北五味子收录为2种不同的药物，二者是木兰科中2种高度相似的植物，南五味子主产于中国岷山和秦岭山脉等地带，北五味子Schisandrachinensis（Turcz.）Baill.主产于中国东北地区。五味子作为收敛剂、镇静剂、适应剂和滋补剂，在中药应用中发挥重要作用，同时具有多种药理功效，如抗炎、降血糖、免疫调节、镇咳平喘及对中枢神经系统和心血管系统的调节作用等［7］。

现代科学分析研究结果显示，南、北五味子的化学成分及含量存在较大差异，南五味子主要含有木脂素和三萜类成分，北五味子主要含有木脂素、有机酸和糖苷类成分，研究发现，五味子酮、安五脂素、华中五脂素和3种2，5二芳基四氢呋喃木脂素为南五味子所特有的木脂素，南五味子中还分离得到3种三萜类化合物：五味子酸、安五酸和schisanol，北五味子中目前未发现三萜类成分［8］，李晓亮等［9］通过建立HPLC指纹图谱分析发现，南、北五味子存在显著差异，五味子酯甲、五味子甲素在南五味子中含量相对较高，而五味子醇甲在北五味子中含量远高于南五味子。

目前，《中国药典》中南、北五味子功效相同，但科学研究发现二者成分存在比较显著的差异，可能会带来功效的差异，目前临床应用中，南、北五味子并没有完全区分开，均以五味子入药。为了更精准合理使用五味子药材，对南、北五味子的成分、药理作用及作用机制等进行深入对比研究非常必要，具有现实指导意义。

网络药理学是通过整合系统生理学和药理学，从系统、整体的角度预测药物治疗疾病作用机制的一门新兴学科［10-11］。这一方法与中医运用整体观念治疗疾病的思路极具相似性，故此，网络药理学技术与中医药研究的关系更为密切，能够更基础、更科学地解释中药复方的药理作用及作用机制［12］。本研究通过网络药理学方法探讨南、北五味子治疗AD的作用机制异同，并通过分子对接技术验证预测结果，为临床应用提供理论支撑。

在TCMSP数据库检索得到南五味子的全部化学成分共39个，北五味子的全部化学成分共130个。以OB、DL和BBB值作为筛选条件及文献补充，得到南五味子活性成分15个（表1），北五味子活性成分13个（表2）。SwissTargetPrediction数据库预测、整理去重后南五味子得到460个作用靶点，北五味子得到373个作用靶点。

在OMIM和GeneCards数据库检索、筛选后共得到与AD相关的6829个靶点。与南、北五味子成分靶点进行对比分析得到，南五味子治疗AD靶点372个，北五味子治疗AD靶点304个，两者治疗AD交集靶点235个，南五味子治疗AD特有靶点137个，北五味子治疗AD特有靶点69个，靶点韦恩图见图1。

基于软件构建“南、北五味子-活性成分-交集靶点”网络图（图2），所构建的网络中包含466个节点，1619条相互作用关系。其中，图形颜色越深表示度值（degree）越大，菱形表示药物名称，圆形表示药物活性成分，长方形表示药物-疾病的交集靶点，连线表示药物、活性成分、靶点之间的相互作用关系。

将利用String数据库获取的PPI网络“TSV”文件导入软件后，通过CytoNCA插件对关键靶点进行筛选，并绘制关键靶点PPI网络图，圆形面积越大、颜色越趋近深色表示度值（degree）越大。南、北五味子治疗AD共性靶点PPI网络图共有235个节点，2799条相互作用关系，利用CytoNCA插件筛选后获得关键靶点71个（图3-A）。关键靶点中度值排名前列的靶点为AKT1、TNF、SRC、EGFR、HSP90AA1。南五味子治疗AD特有靶点网络图共有137个节点，493条相互作用关系，将CytoNCA插件筛选后获得的关键靶点绘制网络图（图3-B），关键靶点中度值排名前列靶点为CASP3、ESR1、HIF1A。北五味子治疗AD特有靶点网络图共有69个节点，103条相互作用关系，将CytoNCA插件筛选后获得的关键靶点绘制网络图（图3-C）。关键靶点中度值排名前列靶点为ADRB2、SLC6A4、ADRBK1。

利用Metascape平台对南、北五味子治疗AD共性靶点进行GO功能富集分析，根据P值筛选排名前10条目进行可视化分析（图4-A）。GO富集分析产生了2129条生物过程（BP），151条细胞组分（CC），229条分子功能（MF）。共性靶点对蛋白质磷酸化、细胞对氮化合物的反应等BP，膜筏、膜微结构域等CC，蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性，醇基为受体等MF具有很强相关性。利用Metascape平台对南、北五味子治疗AD共性靶点进行KEGG通路富集分析，根据P值筛选排名前20条目进行可视化分析（图4-B）。获得KEGG富集分析功能条目201条，涉及PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、MAPK信号通路等。

南五味子治疗AD特有靶点GO功能富集分析结果显示（图5-A），GO富集分析产生了1020条BP，72条CC，109条MF。南五味子特有靶点对激素反应、类固醇代谢过程等BP，膜筏、膜微结构域等CC，核受体活性、配体激活的转录因子活性等MF具有很强相关性。KEGG结果（图5-B），共富集信号通路118条，涉及癌症通路、化学致癌-受体激活、神经活性配体-受体相互作用、Th17细胞分化、PPAR信号通路等。

北五味子治疗AD特有靶点GO功能富集分析（图6-A）结果显示，GO富集分析产生了570条BP，48条CC，67条MF。北五味子特有靶点对蛋白质磷酸化、腺苷酸环化酶调节G蛋白偶联受体信号通路等BP，树突、树突树等CC，G蛋白偶联胺受体活性、蛋白激酶活性等MF具有很强相关性。KEGG结果显示（图6-B），共富集信号通路72条，涉及神经活性配体-受体相互作用、癌症通路、cGMP-PKG信号通路、趋化因子信号通路、cAMP信号通路等。

南五味子特有靶点中度值前3的关键靶点CASP3、ESR1、HIF1A与度值前5的核心活性成分五味子醇甲、五味子甲素、五味子酯甲、新南五味子木脂宁、新杜松烷酸B进行分子对接；北五味子特有靶点中度值前3的关键靶点ADRB2、SLC6A4、ADRBK1和度值前5的核心活性成分五味子醇甲、五味子甲素、五味子酯甲、脱氧三尖杉酯碱、五味子醇乙进行分子对接。结合能＜-20.93kJ·mol-1（-5.0kcal·mol-1）表示小分子配体和蛋白受体之间具有较好的结合活性［12］，结合能越小，对接构象越稳定。分子对接结果表明（图7），各组结合能均＜-20.93kJ·mol-1，核心活性成分与关键靶点具有较好的结合活性。其中，南五味子中CASP3与新杜松烷酸B结合活性最高，北五味子中ADRBK1与五味子酯甲结合活性最高，选取部分结合能较低的对接结果进行可视化展示（图8）。

讨论

AD是多重病理因素导致的不可逆中枢神经系统疾病，多成分、多靶点的治疗方式相对于单一靶点对AD的治疗更为有效，运用中医药多途径、多靶点及整体观念和辨证论治的优势在治疗上效果显著。五味子具有抗氧化、抑制凋亡、抗炎、调节神经递质等药理作用，广泛应用于治疗脑血管疾病、神经退行性疾病和抑郁症等疾病［25］。

本研究中，基于TCMSP数据库和软件构建“药物-活性成分-交集靶点”网络图，图中南、北五味子共含有5种相同活性成分，分别为五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子酚。南五味子15种活性成分中9种为木脂素类物质，北五味子13种活性成分中11种为木脂素类物质。

多项研究表明，五味子木脂素具有治疗AD的作用，Zhou等［3］利用代谢组学方法筛选出54种内源性代谢物，通过生物标志物相关通路和生物学功能分析结果显示，五味子木脂素可能通过神经保护、抗氧化损伤和调节不饱和脂肪酸代谢达到治疗AD的目的。张鸿旭［26］基于粪便代谢组学探究五味子木脂素对AD大鼠的调节作用，结果显示五味子木脂素通过调节AD大鼠体内胆汁酸代谢、能量代谢、亚油酸代谢等代谢通路，减轻神经炎症与氧化应激反应。因此，木脂素是南、北五味子治疗AD的重要物质成分。

根据PPI网络结果分析，AKT1、TNF、SRC、EGFR、HSP90AA1是南、北五味子治疗AD共性关键靶点，一些关键靶点在研究中得到广泛实验验证。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞生长和生存过程的关键介质［27］。牙齿脱落的发生率与年龄增长呈现正相关，由于牙齿脱落造成的咀嚼功能损害可导致认知功能障碍疾病，研究表明，牙齿缺失会降低AKT1的表达水平，进而抑制神经干细胞增殖分化和神经元损伤修复，降低幼年SD大鼠学习和长期记忆能力［28］。

HSP90AA1定位于染色体14，编码热休克蛋白90α（HSP90α），参与蛋白质折叠、组装和降解，对内部平衡至关重要［33］。研究发现，HSP90通过诱导产生IL-6和TNFα和激活TLR4，增强小胶质细胞的吞噬能力，进而促进清除Aβ，且抑制HSP90可以导致tau蛋白磷酸化减少［34］。

基于PPI网络结果，南五味子能通过CASP3、ESR1、HIF1A等特有靶点发挥治疗AD的作用。CASP3是半胱天冬酶家族（caspase，CASP）成员之一，在细胞凋亡和致癌作用中发挥核心作用［35］，实验证明［36］，通过抑制海马CA1区Csapase-3的过度表达，减弱迟发性神经细胞凋亡，能够达到神经保护的目的。

ESR1编码雌激素受体α（ERα），ESR1基因的变异可能与女性对AD易感性增加有关［10］，ERα介导的死亡结构域相关蛋白易位的抑制以及膜ERα与小窝蛋白在胞膜小窝中的联合作用可能预防AD的发生［37］。北五味子则通过ADRB2、SLC6A4、ADRBK1等特有靶点发挥治疗AD的作用。

ADRB2是一种典型的G蛋白偶联受体，在调节能量代谢和优化神经元功能方面发挥重要作用，ADRB2可改善Aβ1-42诱导的线粒体自噬缺陷，改善N2a细胞中Aβ诱导的线粒体功能障碍、氧化应激和tau蛋白过度磷酸化［38］。SLC6A4是神经传递5-羟色胺的最重要的调节因子之一，rs6354是SLC6A4的一个多态性位点，隐性模型关联试验证明rs6354GG基因型与发生AD风险相关［39］。

通过对南、北五味子共性靶点的KEGG富集通路分析发现，富集结果涉及PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路和MAPK信号通路等，这些通路主要与细胞凋亡、氧化应激、炎症反应密切相关，与文献中已报道治疗AD的通路相一致［40-42］。研究表明，北五味子通过钙信号通路发挥抗凋亡和抗氧化作用，降低NO水平，发挥治疗AD的作用［43］。

Yang等［44］实验证明，北五味子藤茎中木脂素能通过激活NF-κB/MAPK信号通路抑制Aβ1-42诱导的小胶质细胞的炎症反应。分析网络药理学研究结果发现，南五味子能通过癌症通路、化学致癌-受体激活、神经活性配体-受体相互作用、Th17细胞分化、PPAR信号通路等发挥治疗AD的作用，例如，Th17细胞通过产生多种细胞因子（如IL-17A、IL-23、IL-21、IL-6和IFN-γ）参与神经炎症反应，Th17细胞及其相关的细胞因子也与神经元中Aβ异常聚集的斑块有关，大脑中活化的Th17细胞及其细胞因子通过促进炎症反应和神经元自噬在AD的病理发展中发挥重要作用［45］。PPAR信号通路上的蛋白PPAR-α能够参与脑内淀粉样前体蛋白（APP）的代谢，并通过Aβ直接或间接影响Tau蛋白的磷酸化，同时PPAR-α的下调可能使AD患者的抗氧化和抗炎能力下降［46］。

北五味子通过神经活性配体-受体相互作用、癌症通路、cGMP-PKG信号通路、趋化因子信号通路、cAMP信号通路等发挥治疗AD作用，例如，cGMP是一种普遍存在的第二信使，是机体和大脑中许多重要信号级联的关键分子［47］。研究发现［48］，cGMP增强了APP与内溶酶体β位点APP裂解酶1（BASE-1）的内体相互作用，从而促进Aβ多肽的生成，并增强突触可塑性和记忆力。同时研究表明［49］，cGMP-PKG信号通路在防止细胞凋亡和促进神经细胞存活方面发挥着重要作用。炎症反应是发生AD的主要病因之一，神经炎症主要是发生在中枢神经系统的炎症反应，趋化因子信号通路能够参与AD神经炎症过程中小胶质细胞向病变区域运动的调节，与中枢神经系统的发育密切相关［50］。

近几年未发现有关南、北五味子通过Th17细胞分化、PPAR信号通路、cGMP-PKG信号通路、趋化因子信号通路治疗AD的相关报道。

五味子已被证明对AD有显著治疗效果，具有改善认知障碍、抗氧化、抑制凋亡等作用［51］，但南、北五味子在临床中应用混乱，且五味子对神经系统疾病的研究也多以北五味子为主，有关南、北五味子治疗AD分子机制差异的相关研究尚未有报道。

本研究基于网络药理学［52］和分子对接技术，对比南五味子与北五味子治疗AD作用机制的异同，两者均含有多种木脂素类活性成分［53］，且五味子木脂素在治疗AD中发挥重要疗效。南、北五味子通过AKT1、TNF、SRC、EGFR、HSP90AA1等共性靶点及其所在的生物过程和通路共同发挥治疗AD的作用，通过CASP3、ESR1、HIF1A、ADRB2、SLC6A4、ADRBK1等各自特有靶点及其所在的生物过程和通路，分别阐述了南、北五味子治疗AD的差异所在。本研究结果为南、北五味子的药理研究和临床应用提供了理论基础，后续有必要通过分子生物学实验和动物实验对结果进一步验证。