1996年，凭借偶像剧《真空爱情记录》出道。
2003年，因在琼瑶剧《还珠格格第三部：天上人间》中饰演夏紫薇一角而被大众所熟知。
2006年，凭借古装剧《乔家大院》获得第23届中国电视金鹰奖-观众喜爱的女演员奖。
2008年1月，马伊琍与演员文章领证结婚。
2010年，凭借情感剧《婚姻保卫战》获得第1届亚洲彩虹奖之最佳女喜剧演员奖。
2011年，凭借情感剧《双城生活》获得了2011国剧盛典-年度最佳女演员奖。
2013年，获得2012中国电视剧年度明星盛典的表演突破奖。
2015年，凭借都市剧《北上广不相信眼泪》获得第19届华鼎奖之中国百强电视剧最佳女主角。
2017年，凭借都市情感剧《我的前半生》获得第24届上海电视节白玉兰奖的最佳女主角等奖项。
2018年，凭借电影《找到你》获得第25届华鼎奖-中国电影最佳女主角等奖项。
2019年7月，马伊琍、文章宣布离婚。
2020年，获得第29届华鼎奖-中国近现代题材电视剧最佳女演员奖。
2021年，凭借电影《爱情神话》提名第33届华鼎奖之中国电影最佳女主角。
2023年4月，领衔主演电视剧《龙城》。同年主演都市剧《繁花》。
马伊琍从小在上海弄堂里长大，15岁时参加上海电视台的综艺舞蹈队，开始自食其力。她那时赚到的演出费不光能付清学校的学费，还有不少的剩余。
1993年，马伊琍被选中主演电影《叛逆大师刘海粟的故事》，那是她的第一次触电经历，并得到了800块的片酬。
1994年，考入上海戏剧学院94级表演系本科。
演艺经历1996年，主演个人首部电视剧《真空爱情记录》，饰演女二号夏文心，该剧也是中国内地首部偶像剧。1998年，马伊琍从上海戏剧学院表演系毕业，同年，主演电影《玻璃是透明的》。1999年，主演青春励志剧《理想万岁》。2001年，主演家庭伦理剧《给我一支烟3：今夜无眠》。
2002年9月，主演管虎执导的剧情片《西施眼》]；11月，在古装剧《铁齿铜牙纪晓岚续》中饰演颜如玉。2003年7月，与古巨基等人共同主演琼瑶剧《还珠格格第三部：天上人间》，在剧中饰演明珠格格夏紫薇，因此被大众熟知。9月，在李亚鹏主演的情感剧《谁都会说我爱你》中饰演女二号林菊若；10月，主演管虎执导的悬疑剧《七日》。2005年9月，主演都市情感剧《五妹》。
2006年2月，与陈建斌等人共同主演古装商战剧《乔家大院》，饰演江雪瑛，并凭借该剧获得第23届中国电视金鹰奖-观众喜爱的女演员奖。4月，与黄磊等人共同主演民国情感剧《天一生水》；10月，主演古装剧《锦衣卫》。
2008年10月，主演年代剧《美丽无声》；11月，怀孕期间拍摄的情感剧《锁春记》首播。
2010年8月16日，与佟大为等人共同主演的情感剧《婚姻保卫战》首播，马伊琍凭借该剧获得第1届亚洲彩虹奖之最佳女喜剧演员奖；8月18日，主演的年代商战剧《经纬天地》在央视八套黄金强档首播，该剧是马伊琍产后复出的首部电视剧；10月，主演青春励志剧《青春期撞上更年期》，并凭借该剧获得优酷影视指数盛典——2011开年盘点之开年优酷指数最佳女演员奖。
2011年4月，与范伟等人共同主演喜剧片《跟踪孔令学》，并凭借该片获得第3届英国万像国际华语电影节之优秀女配角奖。7月，与涂松岩共同领衔主演都市情感剧《双城生活》，并凭借该剧获得了2011国剧盛典-年度最佳女演员奖。
2012年6月，与李晨共同主演情感剧《风和日丽》。
2013年3月29日，马伊琍在2012中国电视剧年度明星盛典中获得表演突破奖；9月，与文章共同主演都市情感剧《小爸爸》，该剧是马伊琍首次担任制片人。2015年11月，主演都市情感剧《北上广不相信眼泪》，并凭借该剧获得第19届华鼎奖之中国百强电视剧最佳女主角。
2016年9月，与陈建斌共同主演都市情感剧《中国式关系》，并凭借该剧提名第23届上海电视节白玉兰奖的最佳女主角奖。
2017年3月，与文章共同主演谍战剧《剃刀边缘》，7月，主演都市情感剧《我的前半生》，在剧中饰演罗子君，并凭借该剧获得第24届上海电视节白玉兰奖的最佳女主角等奖项。7月27日，出演“建国三部曲”系列影片的第三部《建军大业》。
电视剧《我的前半生》中饰演罗子君
2020年5月，马伊琍等人领衔主演的都市职场剧《在不安的世界安静地活》杀青；8月，与高伟光共同领衔主演的民国情感剧《旗袍美探》网台同播，并凭借该剧获得第29届华鼎奖-中国近现代题材电视剧最佳女演员。
2021年12月，与徐峥等人共同主演爱情片《爱情神话》，并凭借该片提名第33届华鼎奖-中国电影最佳女主角。2022年8月，加盟综艺节目《跃上高阶职场》。
2024年2月10日，凭借电视剧《繁花》获得第二届中国电视剧年度盛典年度女演员。5月7日，参演的剧集《我的阿勒泰》播出。
马伊琍的母亲是幼儿园老师。
婚恋与演员文章
2005年，马伊琍与文章通过合作拍摄电视剧《锦衣卫》相识，2006年，两人在拍摄电视剧《奋斗》时开始相恋。2008年1月31日，两人领证结婚。同年9月20日，两人的女儿文君竹出生。2014年1月，马伊琍第二个孩子出生。
2014年3月28日，有媒体拍到了文章和姚笛在一起的照片。3月31日凌晨，文章通过新浪微博发布声明，承认与姚笛的婚外情并向家人道歉；马伊琍也发微博回应：“恋爱虽易，婚姻不易，且行且珍惜”；当天晚上，最先预告文章出轨新闻的《南都娱乐周刊》执行主编谢晓通过微访谈在线与网友交流了他们追踪报道文章婚外情的幕后情况。4月1日，马伊琍的父亲通过新浪微博表明马伊琍和文章不会离婚，文章已获得他们一家的原谅。
2019年7月28日下午，文章、马伊琍正式宣布离婚。
社会活动2004年，马伊琍被中华骨髓库聘请为爱心大使，在当时抽取了造血干细胞并采集了8ml血样，等待需要的病者配型。
2009年09月25日，马伊琍在无锡获得了2009年度“中国国际年度绿色风云人物”。以表彰她积极地参与“保护环境，关爱地球”的公益活动。
2010年6月26日，文章和马伊琍共同发起的专注于自闭症儿童援助的“WeCan”艺术慈善计划在北京启动。
2011年，马伊琍代言了由邓飞等媒体人发起的“免费午餐”公益项目，旨在为贫困地区的孩子提供营养午餐。
2012年10月23日，在电影《三个未婚妈妈》首映礼活动中，马伊琍被聘为南通城市形象宣传大使。
2013年2月，马伊琍通过天使妈妈基金平台为需要换肝的儿童向俊宇捐款4万元。
2015年10月22日，马伊琍被联合国儿童基金会（UNICEF）正式委任为中国大使。12月17日，俄罗斯总理德米特里·阿纳托利耶维奇·梅德韦杰夫在俄罗斯驻华大使馆与中国青年代表座谈。黄晓明、马伊琍、许晴作为中国电影界代表出席活动，并受到俄罗斯总理接见。
2016年9月，由《南方人物周刊》杂志主办的第十二届中国青年领袖致敬盛典在北京举行，马伊琍获得“2016中国青年领袖”奖]。
2018年1月31日，《中国慈善家》揭晓了“2017中国慈善名人榜”，马伊琍排名第22。
2019年6月，担任第25届上海电视节白玉兰奖的评委。
2021年7月，马伊琍向河南暴雨灾区捐款50万元]。
2023年12月，担任第五届海南岛国际电影节金椰奖剧情长片评委会成员。
第十二届中国青年领袖致敬盛典
马伊琍出任联合国儿童基金会大使
黄晓明、马伊琍、许晴获俄罗斯总理接见
中国国际年度绿色风云人物
马伊琍担任中华骨髓库爱心大使
